重点推荐！Science+PNAS更新认识，赋予Caspase-8参与细胞焦亡过程的新功能——邵峰点评

撰稿丨tac.G

点评丨邵峰（北京生命科学研究所）

责编丨迦溆

When cells burst and die, their contents are released, causing inflammation. （图片引自：https://www.medicalnewstoday.com）

在细胞生物学研究中，细胞死亡一直是研究的热点。1972年，Kerr等第一次提出了细胞凋亡（Apoptosis）的概念，随后将其认领为细胞程序性死亡的过程，而与之对应的细胞坏死（Necrosis）则长期被认为是意外、被动的细胞死亡。但在近20年内，随着检测技术和研究方法的进步，关于细胞死亡的分类和概念已经多次更新。其中早期很多被认为是凋亡的死亡模式现在已经被重新定义为坏死性凋亡（Necroptosis）或焦亡（Pyroptosis）等。在2018年Cell Death & Differentiation杂志最新的细胞死亡命名建议（The Nomenclature Committee on Cell Death，NCCD）上，已将细胞死亡类型细分为12种类型（下图）【1】。尽管以凋亡、坏死性凋亡和焦亡为代表细胞死亡类型的信号通路和效应分子都已经基本解析，但这些不同的死亡类型之间并没有严格的壁垒，新的研究仍然在向现有的模型概念发起挑战。

细胞死亡的12种方式

关于凋亡、坏死性凋亡和焦亡的研究内容既复杂又有趣，这些不同的通路间交互的调控模式向我们展示了接受死亡信号后的细胞“一心求死”的愿景。既往研究发现，单独使用TNF（Tumor necrosis factor）可以诱导细胞凋亡，其通路活化主要通过天冬氨酸蛋白酶Caspase-8/3完成。但在TNF处理同时辅以Pan-Caspase抑制剂zVAD处理并没有减少、反而加速了细胞死亡，此时细胞死亡类型已转为坏死性凋亡。在TNF单独处理细胞后，TNF受体TNFR下游可以促进Complex I的募集，包含RIP1（receptor-interacting protein 1），TAK1（TGFβ-activated kinase）等分子，随后RIP1在Complex I活化后与RIP3（receptor-interacting protein 3）、Caspase-8等蛋白构成Complex IIa。Caspase-8在Complex IIa中可以水解RIP1和RIP3，此时坏死性凋亡通路被抑制，细胞将执行Caspase-8介导的凋亡过程。而TNF+zVAD处理抑制了Caspase-8功能，此时由RIP1、RIP3和MLKL（Mixed Lineage Kinase domain Like protein）构成Complex Iib，执行了不依赖Caspase的坏死性凋亡【2】。

细胞焦亡（pyroptosis）主要在炎症性细胞死亡中被发现，早期一直被认为是凋亡过程，近年已解析感染或损伤性信号活化焦亡的下游通路。既往部分革兰氏阴性菌（大肠杆菌E.coli、伤寒沙门氏菌S.typhimurium、嗜肺军团菌L.pneumophila等）的研究发现，细菌在感染后可以通过TLR（Toll-like receptor）受体或者胞质内的感受器活化下游通路，通过炎症小体组装活化炎症性Caspase（Caspase-1/4/5/11），继而活化IL-1β。近年来，邵峰、Dixt VM等课题组率先发现了细胞焦亡的关键通路，发现Gasdermin家族成员为焦亡的效应蛋白，其上游主要接受来自炎症性Caspase的活化信号，通过切割水解为活性的N端蛋白形成寡聚体在胞膜中打孔完成焦亡（特别值得一提的是，邵峰课题组最早系统深入地阐明gasdermin家族蛋白具有打孔和诱导焦亡的活性）【3】。

GSDMD是Gasdermin家族成员，是焦亡的核心效应分子。目前认为GSDMD主要受Caspase-1/4/5/11活化可以在276位Asp进行切割产生活性。近期也有关于其功能的新研究。在中性粒细胞中，GSDMD可以经弹性蛋白酶Elastase水解，介导中性粒细胞发生焦亡【4】。在凋亡通路活化后，GSDMD可经Caspase-3在88位Lys位点发生切割，此时其N端具有活性功能的结构域破坏，丧失了诱导焦亡的功能【5】。而有一些研究也曾发现Caspase-8可参与相关感染免疫通路的调控【6-9】，但具体机制仍不清。

耶尔森氏菌（Yersina）在革兰阴性菌感染中一直是异类的存在。耶尔森氏菌致病成员主要有鼠疫杆菌（Yersinia pestis）、假结核杆菌（Yersinia pseudotuberculosis）、肠结核杆菌（Yersinia enterocolitica）。Yersinia的三种致病株中含有共同的毒力质粒，编码Ⅲ型分泌系统蛋白（type III secretion system）。其中Yops（Yersinia outer proteins）为其编码的分泌性毒力蛋白，含有YopH、YopE、YopJ/YopP、YopO/YpkA、YopM and YopT等成员。1997年，Denise等发现假结核杆菌可以引起巨噬细胞“凋亡”，且该过程依赖YopJ蛋白【10】。后期Paquette等研究也发现YopJ蛋白可抑制MAPK和NF-κB通路的激酶TAK1诱导细胞死亡【11】。

近日，Science和PNAS杂志相继发表了对耶尔森氏菌Yersina感染引起细胞死亡研究的新成果，分别为马萨诸塞大学医学院的Egil Lien和Katherine A. Fitzgerald课题组发表于Science题为Pathogen blockade of TAK1 triggers caspase-8–dependent cleavage of gasdermin D and cell death和塔夫茨大学医学院Alexander Poltorak发表于PNAS题为Caspase-8 induces cleavage of gasdermin D to elicit pyroptosis during Yersinia infection的研究。这两篇文章共同发现耶尔森菌Yersinia感染巨噬细胞后，毒力蛋白YopJ通过抑制TAK1（TGFβ-activated kinase）活性活化了RIP1和Caspase-8。Caspase-8可通过切割GSDMD为活性形式引发焦亡。这两篇研究破除了既往对耶尔森菌引起巨噬细胞凋亡的错误认识，并赋予了凋亡Caspase-8参与焦亡过程的新功能。

两篇文章主体研究思路较为相似，均利用敲除小鼠模型的体外BMDM（骨髓源性巨噬细胞，Bone marrow-derived macrophages）为主要的细胞模型，使用Yersinia菌感染BMDM细胞，并使用LPS+5z7（TAK1抑制剂）处理模拟Yersinia感染。通过监测细胞死亡形态、检测LDH（乳酸脱氢酶，细胞死亡的指标）、IL-1β（炎症小体活化指标）水平等指标，免疫印迹检测胞质与培养上清中GSDMD与Caspase等蛋白活化过程完成主体论证。两篇文章共同证实了Yersinia菌感染巨噬细胞后，Caspase-8通过水解活化Gasdermin引发了细胞焦亡过程。

两篇文章均发现，在野生型Yersinia感染可以诱导细胞死亡，并可伴有Caspase-8及下游其他Caspase的活化，而YopJ缺失的突变株则无此效应。在使用LPS+5z7（TAK1抑制剂）处理模拟野生型Yersinia感染同样可见检测到细胞死亡增加。Rip3-/-Casp8-/-小鼠BMDM对野生型Yersinia感染和LPS+5z7处理呈现不敏感，而Casp1/Casp11-/-小鼠BMDM仍表现为敏感。在感染过程中，免疫印迹实验可看到Caspase-8发生了活化，并且其下游其他凋亡Caspase（Caspase-3/7）和炎症性Caspase（Caspase-1）也发生一定程度活化。Science文在设置感染后时间点，证实Caspase-8活化优先于GSDMD活化，最后才为Caspase-1活化。二文同样观察到野生型Yersinia感染引起巨噬细胞更多呈现焦亡的形态学特征，PNAS文在此处使用时间间隔显微镜摄影，并用PI和Annexin V染色清晰的展示了该型死亡与常规的凋亡和坏死性的差异。

在既往的焦亡模型中，Caspase-1/11是负责活化GSDMD的主要蛋白酶。但Casp1/Casp11-/-小鼠BMDM中仍可以看到GSDMD活化，而Rip3-/-Casp8-/-小鼠则不再发生GSDMD活化过程。Science文使用GSDMD-D276A-KI模型证实D276为Caspase-8的切割位点。PNAS文发现Gasdermin另一成员GSDME也可以在该型细胞死亡中发生活化，其责任蛋白酶仍为Caspase-3。

但两篇文章在部分实验设计上也存在差异，导致部分结论看似有些冲突。在感染处理上，Science文使用鼠疫杆菌Y. pestis和假结核杆菌Y. pseudotuberculosis，PNAS仅使用了毒力较弱的假结核杆菌Y. pseudotuberculosis作为感染菌。在模拟感染模型上，二文均使用LPS+5z7（TAK1抑制剂）处理模拟Yersinia感染，但Science文先使用LPS预处理后再加5z7抑制TAK1功能，而PNAS文主要使用LPS+5z7同时处理BMDM细胞。

Science文发现GSDMD在Yersinia感染后既参与了细胞死亡，也参与了IL-1β活化。当在细胞外使用高浓度K离子抑制NLRP3活化后，发现Yersinia感染后IL-1β释放减少，但没有影响细胞死亡。这更加提示在Yersinia感染后，细胞死亡和炎症小体活化引起的IL-1β释放是有相同上游，但下游又相互独立的两个事件。而这两个下游通路的交融点就在GSDMD分子。Science文提出模型认为，Yersinia感染后GSDMD活化增加膜通透性，使K+外流增多，引起了NLRP3炎症小体的活化，并进一步活化了Caspase-1和IL-1β。这一发现将原本处于Caspase-1/11下游的GSDMD分子升到了炎症小体活化的上游。

PNAS文在该处提出了更复杂的作用模型。其在LPS+5z7同时处理BMDM后没有观察到有IL-1β活化增加，认为较早的5z7处理抑制了NF-κB通路，减少了胞质内pro-IL-1β的转录。在使用较低的MOI（multiplicity of infection，感染复数）的Yersinia感染BMDM后，可在细胞上清检测到IL-1β，而增加了MOI的Yersinia感染反而减少了IL-1β水平。PNAS文认为，在较低的MOI感染中，BMDM细胞呈现两种感染模式，一部分BMDM细胞TAK1仍处于活化状态，仍可以增加pro-IL-1β转录。另一部分BMDM细胞TAK1处于YopJ的抑制中，其胞质内Caspase-8和GSDMD的活化引起炎症小体活化，这些活化的炎症复合体过渡到另一群BMDM中，继续完成对IL-1β的活化。而较高的MOI感染则完全封闭了细胞群体中TAK1功能，也封闭了IL-1β的活化。这一假说也得到PNAS文相关实验的证实。

在Science文的最后，研究人员使用Gsdmd^-/-，Casp1/Casp11^-/-，Rip3^-/-Casp8^-/-小鼠的BMDM进行Yersinia感染试验，发现Casp1/Casp11敲除不影响该型细胞死亡，Gsdmd敲除较野生型和Casp1/Casp11敲除细胞可以延缓细胞死亡，但较Rip3^-/-Casp8^-/-组细胞死亡仍呈明显细胞死亡增加。而使用Salmonella（沙门氏菌）感染，Rip3^-/-Casp8^-/-组与野生型细胞间细胞死亡没有差异，Gsdmd敲除后细胞死亡同样延缓，仍较Casp1/Casp11^-/-组细胞死亡增加。这一结果也提示，在Yersinia活化Caspase-8后，GSDMD可能并不是Caspase-8唯一的下游效应分子。

而在PNAS文最后，研究人员试图使用人源的巨噬细胞验证这一假说。在使用人外周血的PBMC（Peripheral Blood Mononuclear Cell）细胞、人巨噬细胞细胞系U937等感染Yersinia后发现在较高的MOI中，人源巨噬细胞对其十分不敏感，且LPS+5z7处理没有增加细胞死亡。研究人员认为，LPS处理后的人源巨噬细胞中可更多的促存活的因素抑制了细胞死亡。在预先使用5z7处理细胞2h后再经LPS处理可观察到细胞发生死亡，但仍没有像鼠源细胞那样发生明显的死亡，提示人源细胞中可能存在其他促存活的因素可绕过TAK1的抑制作用。

在2014到2017年内，细胞焦亡的研究发生重大进展，邵峰等课题组的研究重新定义了焦亡这一具有17年历史的概念。2018年NCCD将焦亡修正为：一种依赖于gasdermin家族蛋白形成质膜膜孔的可调控的细胞死亡（Regulated cell death），经常但并不总因炎症性Caspase的活化而完成（A type of RCD that critically depends on the formation of plasma membrane pores by members of the gasdermin protein family, often (but not always) as a consequence of inflammatory caspase activation.）【1】。

本文所描述的Science和PNAS文关于Caspase-8活化Gasdermin的故事，继续向过去“炎症Caspase引起焦亡”这一概念发起冲击，并进一步佐证了焦亡的最新定义。

两篇文章的重要性在于，首次阐清了Yersinia感染后引起细胞死亡的通路，发现抑制TAK1活性可以通过Caspase-8对GSDMD发生活化，并且该过程不依赖于对GSDMD有更大酶活性的Caspase-1/11。值得一提的是，邵峰老师课题组在2017年曾解析Caspase-3可以通过酶切GSDME分子激活焦亡【12】。这些研究进一步论证凋亡Caspase与炎症Caspase在下游分子的调控间并不具有严格的界限，而这种交互调控也帮助免疫细胞对抗复杂的病原体时，可以通过不同机制响应感染，帮助“一心求死”的巨噬细胞完成其增敏免疫系统的使命。但关于Yersinia感染后活化IL-1β的过程，可能仍有更复杂的旁路或者作用模式发挥调控作用，仍需要更完备的体内实验去进一步证实。

专家点评

邵峰（中科院院士，北京生命科学研究所研究员、学术副所长）

早在1997年，也就是caspase蛋白被发现后的几年内，研究者就观察到鼠疫杆菌和其它耶尔森菌可以诱导被感染的巨噬细胞发生“凋亡”，且这种“凋亡”完全依赖于细菌分泌至宿主细胞内的YopJ效应蛋白；在过去20年中，这个有趣且重要的生物学现象吸引了很多课题组去探究其相应的分子机制。但这两项最新的研究结果显示，在被耶尔森菌感染的巨噬细胞中，虽然有caspase-8蛋白的活化，但细胞并不是死于之前认为的凋亡，而是gasdermin打孔蛋白介导的焦亡。这个发现说明，被感染的宿主巨噬细胞实际上是通过促炎症性的焦亡而启动了天然免疫防御反应，解决了病原菌感染领域的一个长期令人困惑的问题。更为重要的是，这个发现也提醒我们，caspase介导的细胞死亡不一定是凋亡，细胞死亡的方式关键取决于被caspase切割的底物蛋白是什么。由此延伸出去，我们应该意识到，之前报道的其它细胞凋亡现象，特别是那些由感染或胁迫性信号诱导产生的，也许需要被重新审视。当然这项研究也留下了一个没有解决的问题，为什么当细胞中TAK1的活性在被（YopJ）抑制后，caspase-8可以切割GSDMD使得细胞转向焦亡？

参考文献

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